Sau khi Quentin Beck-Mysterio đăng đoạn video nói về Người Nhện khiến người dân toàn thế giới hiểu nhầm Người Nhện sát hại hắn và tiết lộ danh tính thật của cậu là Peter Parker, dì của Peter là May, MJ và Ned Leeds bị thẩm vấn, nhưng mọi cáo buộc đều được bãi bỏ với sự giúp đỡ của luật sư Matt Murdock. Parker, MJ và Ned nộp đơn vào MIT, nhưng đơn đăng ký bị từ chối do mối quan hệ của MJ và Ned với Người Nhện. Parker đến thăm Sanctum Sanctorum để nhờ phù thủy tối thượng, Stephen Strange giúp đỡ, và Strange gợi ý một cổ thuật có thể khiến mọi người quên đi Peter Parker là Người Nhện. Tuy nhiên, trong khi Strange sử dụng câu thần chú, Peter liên tục yêu cầu thay đổi, khiến nó trở nên bị lỗi và khiến cho những người biết đến thân phận thật của Người Nhện ở những vũ trụ khác bị kéo đến dòng thời gian chính của vũ trụ MCU.

Peter đến cầu Alexander Hamilton để thuyết phục một quản trị viên MIT chấp nhận đơn đăng ký của Ned và MJ, nhưng cây cầu bất ngờ bị tấn công bởi Tiến sỹ Otto Octavius. Peter, mặc bộ đồ Iron Spider, chiến đấu với Octavius ​​tại cây cầu trong khi cố gắng cứu quản trị viên này. Khi Octavius ​​xé toạc Peter khỏi bộ đồ Iron Spider, nó bắt đầu liên kết với các xúc tu cơ học của hắn và cho phép Parker vô hiệu hóa các xúc tu. Sau đó, họ nhận thấy Green Goblin, Norman Osborn, đang bay về phía họ, nhưng trước khi hắn có thể tấn công hai người, Strange đã bắt Octavius ​​và đưa ông ta vào một phòng giam ở Sanctum, cùng với Curt Connors / Lizard. Strange giải thích rằng câu thần chú đã triệu hồi mọi người biết thân phận thật của Người Nhện từ mọi nơi của đa vũ trụ. Strange ra lệnh cho Peter, với sự giúp đỡ của MJ và Ned, tìm và bắt những kẻ còn lại.

Peter xác định vị trí của Max Dillon và Flint Marko trong một khu rừng. Trong khi đó, Norman Osborn, sau khi giành lại quyền kiểm soát bản thân đối với nhân cách Green Goblin bị chia cắt của mình, trở thành một nhân viên của F.E.A.S.T. rồi được May xử lý trước khi Peter tìm thấy ông ta. Strange giam giữ Osborn với những kẻ khác, sau đó chuẩn bị một câu thần chú chứa trong một chiếc hộp sẽ đưa những tên phản diện trở lại vũ trụ. Peter lập luận rằng trước tiên bọn họ nên được chữa khỏi các năng lực bất thường và chứng mất trí của mình, từ đó hy vọng rằng làm như vậy sẽ ngăn chặn cái chết của họ khi trở về. Peter đánh cắp câu thần chú được đóng hộp, và sau một cuộc chiến ngắn ngủi trong Không gian Kính, Strange đã bị bẫy ở đấy trong 12 giờ. Trong khi phát triển các phương pháp chữa trị cho Dillon và Osborn, nhân cách Goblin nắm quyền kiểm soát Osborn và thuyết phục những kẻ phản diện chống lại Peter. Dillon, Marko và Connors trốn thoát còn Osborn phá hủy căn hộ trước khi giết dì May.

Ned học cách mở cổng không gian bằng cách sử dụng nhẫn kép của Strange, cậu và MJ sử dụng nó để cố gắng xác định vị trí của Parker. Thay vào đó, họ vô tình tìm thấy hai phiên bản khác của Parker cũng được triệu hồi bởi phép thuật của Strange, được gọi là "Peter-Two" do Tobey Maguire đóng và "Peter-Three" do Andrew Grafield đóng. Ned và MJ tìm Peter và an ủi cậu, trong khi những Người Nhện khác chia sẻ câu chuyện riêng của họ về việc mất đi những người thân yêu và an ủi cậu chiến đấu vì danh dự của dì May.

Các Người Nhện phát triển những phương pháp chữa trị cho những kẻ phản diện còn lại và dụ Dillon, Marko và Connors đến Tượng Nữ thần Tự do. Peter-Two chữa cho Marko và Peter-One chữa cho Connors. Octavius ​​đến để hỗ trợ và chữa trị cho Dillon. Ned giải thoát Strange khỏi Không gian Kính, nhưng Norman Osborn đến và phá hủy câu thần chú đóng hộp, khiến hàng rào ngăn cách các vũ trụ bị phá vỡ. Trong khi Strange cố gắng duy trì kết giới, Peter suýt giết Norman trong cơn tức giận trước khi Peter-Two thuyết phục cậu ngừng lại. Peter-Three và Peter-One sau đó tiêm thuốc giải cho Norman, khôi phục lại sự tỉnh táo cho ông ta. Peter, nhận ra rằng cách duy nhất để bảo vệ kết giới của đa vũ trụ là xóa cậu ta khỏi trí nhớ của mọi người rồi hứa với MJ và Ned rằng cậu sẽ tìm lại họ. Peter và MJ sau đó ôm hôn nhau. Phép thuật đã được thực hiện, đưa 2 Người Nhện cùng dàn phản diện trở lại vũ trụ của họ và xóa sạch tất cả ký ức về Peter khỏi tâm trí mọi người (bao gồm cả Dr. Strange) trong vũ trụ MCU. Dẫu vậy ký ức về Người Nhện có tồn tại vẫn được giữ lại.

Hai tuần sau, Peter đấu tranh để làm quen lại với MJ và Ned, nhưng sau khi thấy rằng họ đã được nhận vào MIT, cậu thấy mình không thể làm vậy. Trong lúc thăm mộ của dì May, cậu có một cuộc trò chuyện ngắn ngủi với một Happy Hogan mà không hề quen biết cậu.

Bộ phim kết thúc với phân cảnh Peter ngồi cô đơn một mình trong một căn hộ chung cư mới, bên chiếc máy khâu phủ đầy vải vụn. Khi bất chợt bắt được tiếng radio nội bộ của cảnh sát New York, trên chiếc điện thoại cài phần mềm bắt sóng tự chế, Peter liền mặc ngay bộ đồ Người Nhện mới may và lao ra ngoài cửa sổ. Dưới trời tuyết trắng tối nay, Người Nhện có một nhiệm vụ.

Trong một cảnh mid-credit, Eddie Brock bị đưa đến dòng thời gian của MCU và Venom của anh ta quyết định tìm Người Nhện, nhưng đột nhiên bị quay trở lại vũ trụ của họ do phép thuật của Strange, vô tình để lại một phần của symbiote.